Przeciwciało superagonistyczne CD28 wywołuje 2 funkcjonalnie różne fale aktywacji komórek T u szczurów cd

Aby zbadać szybkie efekty JJ316 na ruchliwość limfocytów T, wykonaliśmy wewnątrzlitowe rejestrowanie wideo komórek T w śledzionie. Najpierw przenieśliśmy limfocyty T CD4 + specyficzne dla podstawowego białka mieliny (MBP), które zostały retrowirusowo zaprojektowane do ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (komórki TMBP-GFP) (16). Jak podano wcześniej (5), te efektorowe komórki T rozprowadzono w obszarach czerwonych miazgi i komórek T w białej miazdze śledziony w ciągu 60 godzin po przeniesieniu (Dodatkowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI32698DS1; ). Większość komórek T na stałe poruszała się w tkance w pozornie losowy sposób, jak wskazuje orientacja i niska suma wektorów ich trajektorii (Figura 2A i Dodatkowy film 1). Kilka rozproszonych. Stacjonarnych. Komórki T wykazywały ograniczoną ruchliwość i wydawały się być związane z punktami kotwiącymi. Figura 2 Wizualizacja zatrzymania limfocytów T po iniekcji JJ316 in vivo przez mikroskopię witalną żywych szczurów. (A) Wyznakowane fluorescencyjnie populacje komórek T adaptacyjnie przeniesiono na szczury, a następnie mikroskopię wideo śledziony po 60 godzinach. Nałożone trajektorie 180 nieskutecznych komórek T, 187 komórek TMBP-GFP i 185 komórek TOVA-GFP są wyświetlane i rejestrowane w okresie 10 minut we wskazanych punktach czasowych po traktowaniu JJ316. Suma wektorów trajektorii x, y została obliczona na podstawie sumy wszystkich trajektorii komórek podzielonych przez liczbę komórek. (B) Średnią prędkość nieskutecznych komórek T, komórek TMBP-GFP i komórek TOVA-GFP w śledzionie określono w ciągu 10 minut przed i po (szare tło) leczeniu JJ316 lub PBS. W analizie łącznie 10,080 punktów czasowych uwzględniono linię komórkową T i 180 komórek na przedział czasowy. Każda wartość reprezentuje odstęp minuty. Pokazane są środki 3 niezależnych filmów. (C i D) Średnia prędkość (C) i procent stacjonarnych komórek (D) naiwnych komórek T, komórek TMBP-GFP i komórek TOVA-GFP po traktowaniu JJ316 lub PBS. Mikroskopię wideo wykonywano w odstępach 30-sekundowych, a każdy punkt reprezentował przedział czasowy 10 minut. Wartości reprezentują średnie 2 niezależne filmy na leczenie i linię komórek T zawierającą co najmniej 240 komórek T każda. Przeanalizowano łącznie 131,040 punktów czasowych. Komórki zostały zdefiniowane jako stacjonarne, jeśli migrowały mniej niż 10 .m w 10 minut. Istotność statystyczną określono indywidualnie w teście ucznia. *** P <0,001. Infuzja JJ316 dramatycznie zmieniła zachowanie efektorowych komórek T. W ciągu 2 minut większość komórek TMBP-GFP (> 80%) zwolniła i zmniejszyła ich średnią prędkość z 6. 7. M / min do 1. 2. M / min (Figura 2B i Suplementacja wideo 1). Następnie trajektorie ich komórek zostały skrócone, a liczba stacjonarnych komórek T wzrosła do 70%. 80% (Figura 2, A i D). Niektóre z komórek T uległy agregacji i zaczęły tworzyć skupiska (Supplemental Video 1). Proces ten zakończył się po 3. 4 minuty i pozostał stabilny przez około 90 minut. Następnie ruchliwość limfocytów T powoli odzyskiwała i osiągała poziomy kontrolne w ciągu 3. 24 godzin po wlewie JJ316 (Ryc. 2, C i D oraz Supplemental Videos 2. 4). Ten efekt JJ316 nie był zależny od specyficzności antygenu lub fenotypu limfocytów T. Komórki T efektorowe CD4 + skierowane przeciwko albuminie jaja kurzego (komórki TOVA-GFP) lub świeżo oczyszczone komórki T ze śledziony (składające się z ~ 80% naiwnych komórek. TCR +) zachowywały się pod każdym względem, tak jak komórki TMBP-GFP po infuzji przeciwciała superagonistycznego CD28 ( Rysunek 2). Ponadto, leczenie JJ316 nie wpłynęło na przestrzenny rozkład przeniesionych efektorowych komórek T w śledzionie (dodatkowa Figura 1). Dane te wskazują na wyjątkowo szybki, ale przejściowy wpływ JJ316 na lokomocję komórek T. Terapia superagonistą CD28 indukuje szybką reorganizację cytoszkieletu przy braku polaryzacji komórkowej. Zmiany w ruchliwości komórek T często towarzyszą przegrupowaniu cytoszkieletu (2). To doprowadziło nas do zbadania wpływu JJ316 na cechy morfologiczne za pomocą mikroskopii konfokalnej. Analiza ex vivo ujawniła głęboką aktywację wszystkich subpopulacji limfocytów, w tym komórek T CD4 +, komórek CD8 + i komórek B w ciągu 12 godzin po wlewie JJ316 (Figura 3A). Cytoszkielet F-aktyny został spolimeryzowany, pierwotnie okrągłe komórki przybrały nieregularny kształt, a rozmiar komórki znacznie się zwiększył. Zmiany te były najbardziej widoczne w komórkach T CD4 + eksprymujących FoxP3 (Figura 3, A i B). Co ciekawe, obserwowanym zmianom w obrębie szkieletu nie towarzyszyła polaryzacja komórkowa. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) komórek T CD4 + 12 godzin po iniekcji JJ316 ujawniła okrągłą morfologię i brak dowodów na tworzenie uropod (fig. 3C). Figura 3 Analiza ex vivo wywołanych przez JJ316 rearanżacji cytoszkieletu przez mikroskopię konfokalną i SEM (A) Limfocyty T CD4 +, komórki CD8 + i limfocyty B wyizolowano we wskazanych punktach czasowych po traktowaniu 1,0 mg JJ316 i wybarwiono falloidyną AlAaa Fluor 594 (czerwony) w celu wizualizacji polimeryzacji F-aktyny. Podwójne barwienie przeciwciałem anty-FoxP3 w połączeniu z drugorzędowym przeciwciałem anty-szczurzej Alexa Fluor 488 (zielone) pozwoliło na odróżnienie CD4 + Th i Treg. Pasek skali: 5 m. (B) Średnice 150 pojedynczych komórek na podtyp i punkt czasowy zostały określone ilościowo za pomocą metody komputerowej; oznaczać . standardowy błąd średniej. Analiza statystyczna za pomocą 2-drogowej ANOVA. Gwiazdki odnoszą się do Tregów (pokazanych na górze wykresu), znaków funta do 3 innych typów komórek (pokazanych poniżej wykresu). *** P <0,001; [przypisy: liczne pasma śluzu w moczu, europol wągrowiec, galaktyka starachowice ]