Odwrócenie utraty aksonów i niepełnosprawności w mysim modelu postępującej stwardnienia rozsianego ad 11

W przypadku niektórych eksperymentów komórki węzłów chłonnych hodowano w obecności 1. M fulerenu ABS-75. W ciągu ostatnich 16 godzin komórki poddano pulsacji .l [3H] -tymidyny (PerkinElmer), a następnie zebrano na filtrach z włókna szklanego i analizę włączonej [3H] -tymidyny w liczniku b (1450 Microbeta, Trilux, PerkinElmer ). Supernatanty zbierano po 40 godzinach hodowli do pomiarów cytokin metodą ELISA. Ekspresja CCL2, EAAT1 i GS w pierwotnych astrocytach mysich. Pierwotne astrocyty mysie (> 95% GFAP-dodatnie) przygotowane standardową metodologią stymulowano in vitro TNF-a. (50 ng / ml) lub LPS (1 ug / ml) i IFN-y (100 U / ml) w obecności lub nieobecności 1. M fulerenu ABS-75. Supernatanty z hodowli astrocytów zebrano po 24 godzinach i zmierzono dla CCL2 za pomocą testu ELISA. Ekspresję GS i EAAT1 oceniano metodą western blot na lizatach kultury astrocytów. Stężenie białka w każdej próbce oznaczano za pomocą zestawu kwasu bikinchoninowego (BCA-1, Sigma-Aldrich) i po rozcieńczeniu w celu standaryzacji próbek, taką samą ilość białka wprowadzono do żelu poliakryloamidowego (NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel ; Invitrogen) do oddzielania białka. Próbki przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (Amersham) i po godzinie blokowania (blokujący bufor, Pierce Biotechnology), membrany inkubowano w 4 ° C przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem (królicze anty-GS, G2781, Sigma-Aldrich; królik anty-EAAT1, ab416; Abcam). Jako przeciwciało drugorzędowe użyto przeciwciało przeciw-królicze IgG z peroksydazą chrzanową (Cell Signaling Technology). Konkretne sygnały wizualizowano za pomocą systemu detekcji ECL (Amersham) z filmami rentgenowskimi Fuji (RX NIF). Gęstość optyczną prążków oszacowano przez określenie progu widoczności za pomocą oprogramowania ImageJ (NIH). Ocena uszkodzeń neuronów. Pierwotne neurony z korze szczura (N200200; Genlantis) wysiewano na 24-studzienkowych płytkach powleczonych poli-d-lizyną / lamininą przy 32 x 103 komórek / cm2 i hodowano w pożywce neurobasal / B-27a przez 10 dni. W dniu 11, w pełni zróżnicowane neurony poddano prowokacji albo 50 .M glutaminianem albo 60 .M H2O2 przez 24 godziny albo w obecności lub nieobecności fulerenu 1- (3M ABS-75. Uszkodzenie neuronów oceniano przez barwienie dla MAP-2 (M4403, Sigma-Aldrich), a następnie sprzężone z kozim anty-mysim IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen) i przez pomiar aktywności LDH (test cytotoksyczności nie-radioaktywnej CytoTox 96, G1780; ) jako wskaźnik żywotności komórek. Kultura komórek mikrogleju. Mysią linię komórkową mikrogleju ATCC EOC 20 (CRL-2469) hodowano w 70% ATCC DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 20% kondycjonowanej pożywce z linii komórkowej LADMAC (CRL-2420) i stymulowano peptydoglikanem (ligand TLR2) plus IFN -. w obecności lub nieobecności różnych stężeń fulerenu ABS-75. Wytwarzane przez TLR2 mikroglejowe wytwarzanie NO mierzono za pomocą reakcji Griessa
[podobne: wegarnik zielona góra, europol wągrowiec, bs paslek ]