Niezbędna rola cząsteczki rodziny TNF LIGHT jako cytokiny w patogenezie zapalenia wątroby ad 7

Poziom ALT w surowicy mierzono za pomocą zestawu transaminazowego (Sigma-Aldrich) zgodnie z instrukcjami producenta. W niektórych doświadczeniach, wątroby pobrano od leczonych myszy, utrwalono w roztworze formaliny i zatopiono w parafinie. Skrawki wybarwiono H & E do badania histologicznego. Zapalenie wątroby wywołane przez L. monocytogenes. Myszy infekowano ip wirulentnym L. monocytogenes (szczep DP-L4056), który został dostarczony przez Thomasa W. Dubensky Jr. z Cerus Corp. Następnie monitorowano przeżywalność myszy. W niektórych eksperymentach wątrobę i śledzionę zbierano 3 dni po zakażeniu w celu analizy histologicznej i pomiaru miana bakteryjnego przez wysianie zhomogenizowanych narządów na płytkach CHROMagar Listeria (BD Diagnostics). Analiza Northern blot. Całkowity RNA ekstrahowano z wątroby i śledziony przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Oczyszczone RNA (10 .g / próbka) rozdzielono przez elektroforezę na 1,5% denaturującym żelu agarozowym. Frakcjonowany RNA przeniesiono następnie na membranę Hybond-N + (Amersham Pharmacia Biotech) i poddano blottingowi pełnej długości myszy znakowanej DLP sondy cDNA LIGHT, HVEM, LT. R lub GAPDH przy użyciu zestawu Rediprime (Amersham Pharmacia Biotech) . ELISA specyficzne dla myszy LIGHT. Dwa odrębne L-specyficzne Abs, ML163 i ML209, zostały ustalone jak opisano wcześniej (5). W celu testu ELISA specyficznego dla LIGHT, na płytce naniesiono ML163 (2 .g / ml), a jako detekcję Ab zastosowano sprzężone z biotyną ML209 (5 .g / ml). Test ELISA przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami (5). Liniową krzywą standardową otrzymano z białkiem fuzyjnym LIGHT-flag jako kontrolą dodatnią. Ekspresja genu in vitro i iniekcja hydrodynamiczna. Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) zastosowano do transfekcji genów do komórek 293T zgodnie z instrukcjami producenta. W celu ekspresji genów in vivo, wstrzyknięcie hydrodynamiczne plazmidów, w którym 20 .g plazmidowego DNA w 2 ml PBS wstrzyknięto szybko do żyły ogonowej, przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (27). Śmiertelną dawkę ConA (12,5 mg / kg) połączono w rozcieńczalnikach w niektórych eksperymentach. Generacja mutantów LIGHT. Plazmid kodujący substytucję Phe dla Tyr173 (Y173F) z pojedynczym aminokwasem wytworzono przez 2-etapową reakcję PCR, w której jako matrycę zastosowano cDNA LIGHT typu dzikiego. Najpierw zsyntetyzowano zachodzące na siebie startery oligonukleotydowe kodujące pożądane mutacje i 2 flankujące 5. i 3. startery zaprojektowano odpowiednio za pomocą miejsc restrykcyjnych Xbal i BamHI. Odpowiednie regiony cDNA początkowo amplifikowano stosując odpowiednie nakładające się i flankujące startery. Następnie za pomocą flankującego 5. i 3. startery, fragmenty, których sekwencje zachodziły na siebie, zostały połączone i zamplifikowane. Produkt PCR strawiono Xbal i BamHI i poddano ligacji z wektorami pcDNA3.1 strawionymi XbaI / BamHl (Invitrogen Corp.). Plazmidy kodujące mutanta LIGHT . zaprojektowano do usuwania aminokwasów z Leu63 do Asp84 z LIGHT. LIGHT. L podobnie skonstruowano metodą 2-etapowego PCR z zastosowaniem zachodzących na siebie starterów oligonukleotydowych kodujących sekwencje sąsiadujące z pożądaną delecją. Aby zweryfikować dokładność mutacji, oba mutanty sekwencjonowano przy użyciu analizatora genetycznego ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Statystyka. Poziomy ALT i poziomy LIGHT w surowicy były porównywane między grupami przy użyciu dwustronnego testu ucznia. Eksperymenty przeżycia są przedstawione jako krzywe przeżycia Kaplan-Meier i analizowane przy użyciu testu logarytmicznego. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne w obu testach. Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełnienia danych Podziękowania Dziękujemy Jennifer Osborne za edytowanie rękopisu. Chcielibyśmy podziękować Masao Ichikawie i Cecilii A. Rietz za pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez granty od NIH (CA85721 do L. Chen). Przypisy Niestandardowe skróty: ALT, aminotransferaza alaninowa; B6, C57BL / 6J; Tłumik limfocytów BTLA, B i T; ConA, concanavalin A; HVEM, mediator wejścia wirusa herpes; LIGHT, homologiczny do limfotoksyny, wykazuje indukowalną ekspresję i współzawodniczy z glikoproteiną D HSV o czynnik pośredniczący w wejściu wirusa opryszczki, receptor wyrażany przez limfocyty T; LT (3R, limfotoksyna-. chwytnik. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów
[więcej w: worykonazol, galaktyka starachowice, guz pancoasta ]