Krytyczna rola zewnątrzkomórkowej izomerazy dwusiarczku białka podczas tworzenia skrzepliny u myszy ad 8

Maksymalną aktywność PDI, zdefiniowaną jako 100%, uzyskano przy uwolnieniu mysich płytek krwi w nieobecności inhibitorów. Mikroskopia wewnątrzwitalna. Wewnątrzobrazową wideomikroskopię mikrokrążenia mięśni Cremastera wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (21, 30). Myszy uprzedzono za pomocą dootrzewnowej ketaminy (125 mg / kg masy ciała, Abbott Laboratories), ksylazyny (12,5 mg / kg BW, Phoenix Pharmaceuticals) i atropiny (0,25 mg / kg, American Pharmaceutical Partners). Wprowadzono rurkę dotchawiczą i mysz utrzymywano w temperaturze 37 ° C na kontrolowanym termicznie kocu gryzoni. Aby utrzymać znieczulenie, Nembutal (Abbott Laboratories) był podawany przez kaniulę umieszczoną w żyle szyjnej. Po nacięciu moszny jądro i otaczający mięśnie cremastera wyeksponowano na tacce mikroskopowej do mikroskopii wewnątrzustnej. W całym doświadczeniu preparat Cremaster poddano superpotężeniu za pomocą kontrolowanej termicznie (36 ° C) i napowietrzonej (95% N2, 5% CO2) soli fizjologicznej buforowanej wodorowęglanem. Dane z mikrosiwek uzyskano za pomocą mikroskopu Olympus AX z obiektywem zanurzonym w wodzie x 0,9 nm. System mikroskopii fluorescencji śródocznej został wcześniej szczegółowo opisany (31). Cyfrowe obrazy zostały wykonane kamerą Cooke Sensicam CCD w formacie 640 × 480. Uszkodzenie wywołane laserem. Uszkodzenie ścian naczynia indukowano za pomocą mikropunktowego systemu laserowego (instrumenty fotoniczne), skupionego przez obiektyw mikroskopu, parfokalnego z płaszczyzną ogniskową i wycelowanego w ścianę naczynia (14). Zazwyczaj lub 2 impulsy były wymagane do wywołania uszkodzenia ściany naczynia. Wielkość urazu, jaką wykonano, była porównywalna do ciężkich uszkodzeń laserowych opisanych przez innych (32, 33), ale różniła się od powierzchownych lub umiarkowanych obrażeń tych samych grup. Wielokrotne zakrzepy badano na pojedynczej myszy, z nowymi zakrzepami utworzonymi powyżej wcześniejszych skrzeplin, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu zakrzepów wytwarzanych wcześniej w badanym zwierzęciu. Nie zaobserwowano charakterystycznych tendencji w zakresie wielkości skrzepliny lub składu skrzepliny w sekwencyjnym skrzeplinie generowanej u pojedynczej myszy podczas eksperymentu. Analizę obrazu przeprowadzono za pomocą Slidebook (Intelligent Imaging Innovations). Dane fluorescencji rejestrowano cyfrowo z prędkością do 50 klatek na sekundę i analizowano, jak opisano wcześniej (21). Zwykle obrazy fluorescencji szerokiego pola rejestrowano przy czasach ekspozycji 20 ms, podczas gdy obrazy jasnego pola rejestrowano przy czasach naświetlania 10 ms. Dane zbierano przez 3. 5 minut po uszkodzeniu ściany naczynia. Reprezentatywne barwne obrazy wklęsłodrukowe były binaryzowane za pomocą procedury progowej, w której tło jest zdefiniowane jako średnia fluorescencja maski przed zakrzepem. Pełne zestawy danych z reprezentatywnych i wielu identycznych eksperymentów przedstawiono graficznie, wykreślając zintegrowaną intensywność fluorescencji wszystkich pikseli w obrazie, niezależnie od ich intensywności, w funkcji czasu. Kinetykę tworzenia skrzeplin analizowano przez określenie mediany wartości fluorescencji w czasie w przybliżeniu 20. 30 skrzeplin (31). Czas krwawienia ogona. Czasy krwawienia zostały określone zgodnie z wcześniejszym opisem (18). Samce myszy (C57BL / 6, 6. 8 tygodni) znieczulono i mysie IgG2a lub monoklonalne przeciwciało anty-PDI RL90 wstrzyknięto przez kaniulę szyjną. Po 5 minutach ogon myszy został przecięty 5 mm od wierzchołka za pomocą żyletki. Krwawiący ogon zanurzono w 12-ml probówce testowej zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, wstępnie ogrzaną w 37 ° C i mierzono czas do zatrzymania przepływu krwi. Czas krwawienia ustalono, gdy krwawienie ustało na 10 sekund. Czas krwawienia przekraczający 15 min odnotowano jako 15 min. Ilość krwawienia zmierzono ilościowo przez pomiar zawartości hemoglobiny w krwi pobranej do 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Po odwirowaniu w celu osadzenia czerwonych krwinek, osad poddano lizie przy użyciu 5 ml buforu do lizy (8,3 g / l NH4CI, 1,0 g / l KHCO3 i 0,037 g / l EDTA), i zmierzono absorbancję próbki przy 575 nm. . Statystyka. Dla eksperymentów z krwawieniem, dane analizowano statystycznie za pomocą ANOVA (nieparametryczne) przy użyciu GraphPad Prism (GraphPad Software). Jeśli ANOVA przenosi wartość P mniejszą niż 0,05, przeprowadzono test Dunna w celu dalszej oceny istotności. Różnice zostały uznane za znaczące w P. 0,05. Dodatkowe materiały Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Dziękujemy Vivien Chen za pomocne dyskusje, Margaret Jacobs, za pomoc w oczyszczeniu bacytracyny za pomocą HPLC oraz Snezna Rogelj za dar bacytracyny wolnej od proteazy. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health. Przypisy Niestandardowe skróty: PDI, disiarczkowa izomeraza białkowa. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin. Invest.118: 1123 1131 (2008). doi: 10.1172 / JCI34134 Zobacz powiązany artykuł o izomerazie dwusiarczku białka działa jako sygnał odpowiedzi na uraz, który wzmacnia wytwarzanie fibryny poprzez aktywację czynnika tkankowego.
[patrz też: księgarnia orbita rybnik, guz pancoasta, boboland siedlce ]